Presso l’IRCCS Policlinico San Donato vi è la sede operativa della Fondazione Malattie Miotoniche. Il Prof. Giovanni Meola, Presidente della FMM, è Direttore della Unità Operativa Complessa di Neurologia e responsabile del Centro delle Malattie Neuromuscolari, convenzionato con il SSN. L’IRCCS Policlinico San Donato nella figura del Prof. Meola e dei suoi collaboratori, rappresenta un centro di eccellenza in Italia per la diagnosi clinica e il trattamento delle malattie miotoniche.

La diagnosi strumentale delle Malattie Neuromuscolari, ed in particolare delle distrofie miotoniche di tipo 1 e 2 e delle canalopatie muscolari, viene effettuata nel Laboratorio di Istopatologia Muscolare e Biologia Molecolare dove operano ricercatori con borse di studio elargite dalla FMM.

Effettuazione di specifici esami di laboratorio (dosaggio delle CPK seriche), dell’esame elettromiografico e della BIOPSIA MUSCOLARE; questi esami consentono di giungere ad una precisa diagnosi delle malattie neuromuscolari.

BIOPSIA MUSCOLARE

Fra i servizi offerti dalla Divisione di Neurologia e dal Laboratorio di Istopatologia Muscolare e Biologia Molecolare dell’ospedale, la biopsia muscolare risulta ancora di fondamentale importanza per la corretta diagnosi di alcune malattie neuromuscolari.

La biopsia muscolare è una tecnica convalidata a livello internazionale, consistente in un prelievo di un piccolo campione di muscolo scheletrico in anestesia locale ed in modo atraumatico. Le colorazioni di routine delle sezioni del muscolo devono essere effettuate in laboratori specializzati in metodiche istologiche, istochimiche e istoenzimatiche specifiche per il muscolo scheletrico, quale il Laboratorio di Istopatologia Muscolare e Biologia Molecolare coordinato dalla Dott.ssa Cardani. Queste colorazioni, abbinate a tecniche di immunoistochimica e biologia molecolare, permettono al neurologo di completare l’inquadramento clinico del paziente e raggiungere quindi una corretta diagnosi di malattia. Le colorazioni istologiche (Ematossilina-Eosina, Tricomica di Gomori), infatti, permettono di effettuare un’analisi morfologica del tessuto che permette di valutare diversi parametri che possono essere alterati in alcune patologie, quali la posizione dei nuclei e la forma e il diametro delle fibre. Le colorazioni istochimiche (PAS, ORO) permettono invece di valutare il contenuto di particolari molecole nelle fibre muscolari, quali il glicogeno e i lipidi, mentre grazie alle colorazioni istoenzimatiche (SDH, COX, NADH) è possibile verificare il funzionamento di alcuni enzimi la cui attività è fondamentale per la corretta funzionalità del muscolo scheletrico. Le tecniche immunoistochimiche permettono infine di verificare la corretta espressione e localizzazione in situ di specifiche proteine (miosine, desmina, distrofina…).

La Distrofia Miotonica di tipo 2 (DM2) è una delle patologie neuromuscolari per cui è ancora necessario effettuare la biopsia muscolare per arrivare ad una corretta diagnosi della patologia. A causa della complessità e della difficile interpretazione dei test genetici, l’analisi istopatologica e biomolecolare del muscolo scheletrico rappresentano ancora un valido metodo addizionale per ottenere una diagnosi definitiva. Le metodiche applicate sulla biopsia possono infatti permettere di visualizzare le principali caratteristiche istopatologiche dei muscoli DM2 quali la variabilità del calibro fibrale, i nuclei centralizzati e la presenza di raggruppamenti di nuclei nell’endomisio (nuclear clumps). La caratteristica peculiare che permette di discriminare fra DM2 e altre patologie neuromuscolari è che le alterazioni istopatologiche del muscolo scheletrico sono selettivamente a carico delle fibre di tipo 2. Sulle sezioni di muscolo scheletrico ricavate dalla biopsia muscolare si può inoltre effettuare la tecnica di ibridazione in situ che permette di evidenziare rapidamente l’RNA mutato all’interno dei nuclei delle fibre muscolari.

La disponibilità di una biobanca risulta infine di fondamentale importanza per la ricerca scientifica nel campo delle malattie neuromuscolari. Nel laboratorio di Istopatologia Muscolare e Biologia Molecolare, previo consenso informato del paziente, vengono raccolti e conservati campioni di muscolo scheletrico e cellule muscolari di pazienti affetti da miotonie distrofiche non distrofiche o da altre patologie neuromuscolari, tra cui quelli miotonici. Questo materiale è messo a disposizione dell’intera comunità scientifica nazionale ed internazionale che lavora nell’ambito della ricerca sulle malattie neuromuscolari.

Collaborazioni scientifiche internazionali del CMN sulla biopsia muscolare: prof. B. Udd – Università di Helsinki – Finlandia

Esempi di colorazioni istochimiche effettuate in laboratorio per la diagnosi di malattia neuromuscolare:

  • PAS
  • ATPasi 4.3, 4.7 e 9.4
  • NADH
  • SDH (succinico deidrogenasi)
  • COX (citocromo ossidasi)
  • Oil Red O (ORO)
  • Fosfatasi acida
  • COX+SDH

Pannello di anticorpi utilizzati per la diagnosi:

  • Anti-Disferlina (tipo 1 e tipo 2)
  • Anti-Distrofina (C-terminale, N-terminale e dominio Rod
  • Anti-Sarcoglicani
  • Anti-Desmina
  • Anti-Caveolina 3
  • Anti-Spectrina
  • Anti-Miosina (Fast, Slow, Developmental, Fetal)
  • Anti-SERCA1
Pannello Anticorpi
Pannello Anticorpi

Atrofia fibre II° tipo in paziente affetto da Distrofia Miotonica tipo 2 (DM2) – Anti miosina Fast. 

Anti miosina Fast.
Anti miosina Fast.

Applicazioni di metodiche biomolecolari mediante FISH (Fluorescent insitu hybridization) alla biopsia muscolare

CAG-probe Texas Red, DAPI
CAG-probe Texas Red, DAPI
Paziente DM2 con inclusioni ribonucleari
Paziente DM2 con inclusioni ribonucleari


In alcuni casi selezionati, si può procedere all’ ESAME BIOMOLECOLARE DEL DNA LINFOCITARIO

Dal DNA linfocitario, ottenuto dal prelievo ematico, è possibile eseguire indagini genetiche con metodiche sofisticate (PCR, Southern Blot, FISH, ecc), che permettono di evidenziare la mappatura del sito genico della malattia o della mutazione/delezione responsabili di una malattia genetica neuromuscolare.

Il test genetico (noto anche come test del DNA) è una diagnosi definitiva per stabilire se una persona ha o meno una Distrofia Miotonica.

Il test si esegue su un campione di sangue analizzando il DNA presente all’interno dei globuli bianchi.

Per la Distrofia Miotonica di tipo 1 vengono quantificate il numero di triplette CTG nel gene DMPK sul cromosoma 19.

Le persone sane presentano un numero di triplette che va da 5 a 34.

Le persone con una espansione da 37 a 50 triplette presentano una “premutazione” ovvero pur non presentando alcun segno clinico possono trasmettere l’anomalia genetica ai figli come tale o con una ulteriore espansione di tripletta. In presenza di una ulteriore espansione la malattia si manifesta clinicamente.

In presenza di più di 50 triplette si fa diagnosi di malattia di Steinert.
Dato che è presente una correlazione tra il numero di triplette e la gravità della malattia si distinguono tre gruppi di espansione patologica:
E1: da 50 a 150 ripetizioni
E2: da 150 a 1000 ripetizioni
E3: più di 1000 ripetizioni

Per la Distrofia Miotonica di tipo 2 si valuta il grado di espansione della tetrapletta CCTG nel gene ZFN9 sul cromosoma 3.

Nelle persone con una espansione maggiore di 75 tetraplette si conferma la diagnosi di DM2.
Il test genetico per la DM2 viene eseguito solo in alcuni centri e richiede diversi mesi. Inoltre si è visto che l’espansione delle tetraplette non è stabile e può avere valori diversi nei diversi tessuti ed aumenta con l’età (rendendo difficile l’interpretazione dei risultati).

 

Perché è importante eseguire il test genetico?

  • per confermare la diagnosi eliminando la necessità di ulteriori test medici, riducendo così l’ansia sulla causa dei sintomi.
  • Perché le coppie che desiderano avere un figlio possano prendere decisioni sulla pianificazione familiare in base al loro rischio genetico.
  • Perché le madri con DM1 possano avere un monitoraggio speciale durante la gravidanza e prepararsi per i rischi associati a un bambino nato con DM congenito.

Collaborazioni scientifiche internazioni del CMN sull’esame biolomecolare del DNA linfocitario:
Prof. R. Krahe – università di Houston – USA
Prof. M. Hanna – università di Londra
Prof. B. Fontaine – Università di Parigi

Paziente affetto da distrofia miotonica di tipo 2 (DM/2): mappatura del DNA al cromosoma 3q21
Paziente affetto da distrofia miotonica di tipo 2 (DM/2):
mappatura del DNA al cromosoma 3q21